环球时报 05-23
石正丽新研究:病毒与宿主间有进化军备竞赛,需持续监控蝙蝠
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石正丽等中国科学家发现:进化的 " 军备竞赛 "(arms race)塑造了病毒及其受体的多样性。鉴定涉及种间传播的关键残基对于预测潜在的病原体、了解病毒如何从野生动物向人类跃迁,非常重要。

以前,研究者已经在中华菊头蝠中鉴定出具有不同遗传特征的 SARS 相关冠状病毒(SARSr-CoV)。而这份最新研究还展现了中华菊头蝠种群中蝙蝠受体 ACE2(血管紧张素转化酶 2)的高度多样性。这些 ACE2 变体支持 SARS 病毒和 SARS 相关冠状病毒的感染,但对不同刺突蛋白具有不同的结合亲和力。

SARS 相关冠状病毒刺突蛋白对人 ACE2 拥有更高结合亲和力,显示这些病毒具有向人类跃迁传染的能力。ACE2 和 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白之间的界面处残基的正向选择,表明它们之间存在长期和持续的协同进化动力学。因此,持续监视蝙蝠中的这一组病毒对于预防下一个 SARS 样疾病非常必要。以上研究来自中科院武汉病毒所石正丽团队与福建师范大学生命科学学院欧阳松应教授在预印本平台 bioRxiv 上发表的论文:Evolutionary arms race between virus and host drives genetic diversity in bat SARS related coronavirus spike genes。

中华菊头蝠是 SARS 病毒的宿主,其体内还携带多种 SARS 相关冠状病毒。这些病毒具有高度的遗传多样性,尤其是病毒的刺突蛋白基因。尽管有着不同程度的变异,一些蝙蝠 SARS 相关冠状病毒仍可以利用人类受体 ACE2 进入人体细胞。研究者推测,蝙蝠的 ACE2 受体和 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白之间,有着相互作用,而这驱动了 SARS 相关冠状病毒的遗传多样性。

研究者鉴定出了一系列中华菊头蝠 ACE2 变异体,这些变异体中有一些与 SARS-CoV 刺突蛋白有相互作用的多态位点。携带不同刺突蛋白的伪病毒或 SARS 相关冠状病毒,在表达了蝙蝠 ACE2 变体的细胞中有着不同的瞬时感染效率。通过测定 SARS 病毒、SARS 相关冠状病毒刺突蛋白与蝙蝠受体、人类受体分子之间的结合亲和力,能观察到相关的结果。

所有被测试的蝙蝠 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白与人 ACE2 的结合亲和力,均高于其对蝙蝠 ACE2 的结合亲和力。不过 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白与人 ACE2 的结合亲和力,比 SARS-CoV 刺突蛋白与人 ACE 的亲和力低 10 倍。

结构建模表明,刺突和 ACE2 之间的结合亲和力差异可能是由于这两个分子界面中某些关键残基的改变而引起。分子进化分析表明,这些残基处于强的正选择。

这些结果表明 SARS 新冠病毒刺突蛋白和蝙蝠 ACE2 可能随着时间的推移而互相进化,并经历彼此的选择压力,从而触发了进化的 " 军备竞赛 " 动力学。这进一步证明了,中华菊头蝠是 SARS 相关冠状病毒的天然宿主。

冠状病毒是包膜病毒,包含单股正链 RNA。该亚科有四个属,即 α、β、γ 和 δ。α 冠状病毒和 β 冠状病毒起源于蝙蝠或啮齿动物,而 γ 冠状病毒和 δ 冠状病毒起源于鸟类。自 21 世纪初以来,三种 β 型冠状病毒已引起人类严重肺炎暴发。分别是 SARS-CoV,MERS-CoV 和 SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2 引发的疫情使人们回想起 17 年前发生的 SARS 疫情。SARS 是一种人畜共患病,在接下来的几年中,科学家从中国和欧洲不同地区的蝙蝠中检测或分离出了具有不同遗传特征的 75 种 SARS 相关冠状病毒(SARSr-CoV)。

蝙蝠 SARS 相关冠状病毒与人类和果子狸的 SARS-CoVs 有 96%的核苷酸序列相似度,其中可变区最多的是刺突蛋白(S)和辅助蛋白 ORF3 和 ORF8。此外,研究者已经确定了不同蝙蝠 SARS 相关冠状病毒基因组中能找到 SARS-CoV 的所有基因构建基块,这表明 SARS 病毒的祖先是通过蝙蝠 SARS 相关冠状病毒基因组的重组而来,其起源于蝙蝠。

病毒感染的第一步是识别细胞受体,这也是必不可少的步骤。冠状病毒的进入是由病毒刺突蛋白(Spike,S)和细胞表面受体之间的特异性相互作用介导,然后病毒与宿主膜之间发生融合。冠状病毒刺突蛋白在功能上分为两个亚基:细胞附着亚基(S1)和膜融合亚基(S2)。 S1 区域包含 N 端结构域(NTD)和 C 端结构域(CTD);两者均可用于冠状病毒受体结合(RBD)。

对于 SARS-CoV,其 S1-CTD 作为 RBD 与细胞的受体即血管紧张素转换酶 2(ACE2)结合。冷冻电镜和晶体结构分析,确定了 SARS 病毒的 S-RBD 与人 ACE2 之间界面中的一些关键残基。根据 S 蛋白的大小,蝙蝠 SARS 相关冠状病毒可以分为两个不同的进化枝。进化枝 1 包含病毒具有与 SARS 病毒大小相同的刺突蛋白。而由于 5、12 或 13 个氨基酸缺失,属于进化枝 2 的病毒其刺突蛋白则比 SARS 病毒的小。

尽管 RBD 有所不同,所有进化枝 1 毒株都可以使用 ACE2 进入细胞,而进化枝 2 毒株则由于上述缺失无法直接进入。这些结果表明,就基因组相似性和 ACE2 的使用而言,进化枝 1 的成员很可能是 SARS 病毒的直接来源。

ACE2 在功能上分为两个结构域:N 末端结构域参与 SARS-CoV 结合,C 末端结构域参与心功能的调节。先前的结果表明,不同来源的 ACE2 的 C 末端结构域相对保守,而 N 末端结构域在物种间显示出更多的多样性。此前已证明 SARS 病毒可以利用水鼠耳蝠的 ACE2 和中华菊头蝠的 ACE2。RBD 结合位点中的微小突变,可将 ACE2 从对 SARS-CoV 结合不易感转变为易感。由于属于进化枝 1 的所有 SARS 相关冠状病毒都可从中华菊头蝠体内提取出来,而且也都可以利用 ACE2,因此研究者提出问题:中华菊头蝠 ACE2 中的变异是否可能有导致了蝙蝠 SARS 相关冠状病毒的多样性。

研究团队研究了中华菊头蝠 ACE2 基因的多态性,并通过分子进化分析,蛋白质亲和力测定和病毒感染测定相结合,评估了它们对不同蝙蝠 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白的敏感性和结合亲和力。结果表明,SARS 相关冠状病毒的刺突蛋白多样性可能会受到中华菊头蝠 ACE2 变体的自然选择压力; 在长期共存期间,SARSr-CoV 刺突蛋白可能会被中华菊头蝠的 ACE2 选择,以维持自身遗传多样性并适合中华菊头蝠的种群。

ACE2 基因在中华菊头蝠种群中表现出高度多态性

根据蝙蝠 SARS 相关冠状病毒的流行情况以及样品组织的可用性和质量,研究者使用来自三个省(湖北,广东和云南)的样品进行 ACE2 扩增。

除了团队先前测序过的蝙蝠 ACE2(分别从湖北,广西和云南收集的样本 ID 832、411 和 3357)和其他蝙蝠 ACE2(GenBank 登记号 ACT66275,这是从香港收集的样本)外,研究者从 21 只中华菊头蝠蝠个体中获得了 ACE2 基因序列:湖北有 5 个,广东有 9 个,云南有 7 个。这些蝙蝠 ACE2 序列在其物种内显示 98-100%的氨基酸同一性,与人 ACE2 的显示 80-81%的氨基酸同一性。

这些蝙蝠 ACE2 在 N 端区域观察到了主要变化,包括一些先前已确定与 SARS 病毒的 S-RBD 接触的残基。根据非同义 SNP 分析鉴定出 8 个残基,包括 24、27、31、34、35、38.41 和 42。这 8 个残基的组合产生了 8 个等位基因,包括 RIESEDYK,LIEFENYQ,RTESENYQ,RIKSEDYQ,QIKSEDYQ, RMTSEDYQ,EMKT KDHQ 和 EIKT EIKTKDHQ,分别命名为等位基因 1-8。

除了先前研究(等位基因 4、7 和 8)中的 ACE2 基因型数据外,研究者在中华菊头蝠种群中还鉴定出 5 个新的等位基因。" 等位基因 2" 在两个省的样本中有发现," 等位基因 4" 在 3 个省中有发现,而其他等位基因似乎在地理上受到限制。总之,在广东发现了 3 个等位基因(4、6 和 8),云南发现了 4 个等位基因(1、2、4 和 7),在湖北发现了 3 个等位基因(2、4 和 5),在广西和香港分别找到了 1 个等位基因。在发现 SARS 病毒直接祖先的云南一蝙蝠洞中,研究者发现了 4 个等位基因共存。

综上所述,这些数据表明 ACE2 变异体已经在不同地区的中华菊头蝠种群中长期存在。与 SARS 病毒的 S-RBD 直接接触的位点的取代,表明它们在 SARS 病毒的进化和传播过程中可能具有重要功能。

中华菊头蝠 ACE2 变体对 SARS 相关冠状病毒感染表现出的不同敏感性

为了评估不同的中华菊头蝠 ACE2 分子是否会影响 SARS 病毒和蝙蝠 SARS 相关冠状病毒的进入,研究者在 HeLa 细胞中瞬时表达了中华菊头蝠的 ACE2 的变体,并测试了携带不同刺突蛋白的 SARS 病毒伪型或蝙蝠 SARS 相关冠状病毒的进入效率。

4 株蝙蝠 SARS 相关冠状病毒按照 S1 序列可分为 4 个基因型。简单地说,与 SARS 病毒的刺突蛋白相比,SARS 相关病毒 RsWIV1 的 RBD 与 SARS 病毒具有氨基酸高度同一性;RsWIV16 是 SARS 病毒的近亲,在 NTD 和 RBD 均表现氨基酸高相似;Rs4231 在 NTD 上与 SARS 病毒有着高度的氨基酸相似度;而 RsSHC014 在 NTD 和 RBD 区域与 SARS 病毒均有差异。

与之前的研究结果类似:所有四株具有相同基因组背景但不同刺突蛋白的蝙蝠 SARS 相关冠状病毒毒株,都可以利用人类 ACE2 进行相似水平的复制。

然而,它们在如何利用中华菊头蝠 ACE2 方面存在一些差异。所有测试病毒都能有效利用等位基因 1、2、4、5 进入。具有相同 RBD 的 RsWIV1 和 RsWIV16 则不能使用来自广东的等位基因 6 ( 样本 ID 1434 ) 。具有相同 RBD 的 Rs4231 和 RsSHC014 不能分别使用来自云南和广东的等位基因 7 ( 样本 ID 3357 ) 和等位基因 8 ( 样本 ID 1438 ) 。SARS 病毒 BJ01 与 WIV1 和 WIV16 的 RBD 有很高的相似性,能够在假型感染实验中使用与 Rs4231 和 RsSHC014 相同的蝙蝠 ACE2 等位基因。

这些结果表明,病毒进入细胞都受到刺突 RBD 和中华菊头蝠 ACE2 变异体的影响。

蝙蝠 ACE2 残基突变会影响其与 SARS 相关冠状病毒 RBD 的结合亲和力

为进一步了解 SARS 病毒和 SARS 相关冠状病毒对 ACE2 使用能力不同,研究者表达了冠状病毒 BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014 的 RBD,和 3 个中华菊头蝠的 ACE2,分别是等位基因 6 ( 样本 1434 ) ,等位基因 7 ( 样本 3357 ) 和等位基因 2 ( 样本 5720 ) 。

随后,研究者测试它们之间的亲和力。阳性对照为 SARS 病毒 BJ01 的 RBD 与人 ACE2,阴性对照为 SARS 病毒 RsWIV1 的 RBD 与人 DPP4。实时分析表明,基于平衡解离常数 KD,不同 RBD 与 ACE2 的结合亲和力不同。

与病毒感染实验结果一致,发现 1434ACE2 ( 等位基因 6 ) 与 RsSHC014 和 BJ01 结合,而与 RsWIV1 的 RBD 不结合;研究还发现 3357ACE2 ( 等位基因 7 ) 与 RsWIV1 结合,但不与 RsSHC014 和 BJ01 的 RBD 结合;5720ACE2 ( 等位基因 2 ) 被发现能结合所有测试的 RBD。所有被测试的 RBD 都与人类或蝙蝠 ACE2 具有很高的结合亲和力。然而,与两种蝙蝠 SARS 相关冠状病毒的 RBD 相比,它对中华菊头蝠 ACE2 的结合亲和力较低。

这些结果表明,刺突 RBD 与 ACE2 的结合亲和力影响病毒的感染能力。

SARS 相关冠状病毒 RBDs 与中华菊头蝠 ACE2s 相互作用的结构模型

4 个蝙蝠 SARS 相关冠状病毒的刺突蛋白大小相同,与 SARS-CoV 的氨基酸同源性超过 90%,表明这些蛋白具有 228 个相似的结构。在本研究中,他们使用中华菊头蝠 ACE2 3357(等位基因 7 ) 构建了蝙蝠 SARS 相关冠状病毒 RsSHC014 RBD 的结构复杂模型,并用中华菊头蝠 ACE2 1434 ( 等位基因 6 ) 构建了蝙蝠 SARS 相关冠状病毒 RsWIV1 RBD 的结构复杂模型。

这与 SARS-CoV RBD 与人类 ACE2 的结合亲和实验结果一致。与 SARS-CoV RBD 和人类 ACE2 界面的接触残基相比,可以观察到 ACE2 上的两个病毒病毒结合热点 ( hotspot hotspot Lys31 和 Lys353 分别由 Glu35 和 Asp38 组成的盐桥 ) 或附近的变化。如前所述,这两个热点隐藏在疏水环境中。它们为病毒 - 受体结合相互作用提供了大量的能量,并填补了结合界面上疏水性叠加 238 相互作用的关键空隙。

与人 ACE2 相比,中华菊头蝠 ACE2-3357 的两个主要残留变化是 E35K 和 Y41H。E35K 与 RsSHC014 RBD 中 K31 和 Arg479 的盐桥断裂,可能影响它们之间的结合亲和力。41 位置的组氨酸可能会削弱 K353- d38 盐桥的支撑力,因为组氨酸比酪氨酸的疏水性更弱,导致其与 BJ01 RBD 的结合亲和力降低。因此,BJ01 和 RsSHC014 RBD 与中华菊头蝠 ACE2 -3357 的结合亲和力较低。

在中华菊头蝠 ACE2-1434 中,位置 31 发现了苏氨酸,这与人类 ACE2 的这个位置不同,人类的是赖氨酸。虽然 K31T 的变化导致其不能与 Glu35 形成盐桥,但 BJ01 的 RBD c 中的 Tyr442 可以与之形成氢键。但 RsWIV1 RBD 中位于 442 的丝氨酸则不具备这种功能。

此外,RsSHC014 含有一个位于 479 的精氨酸,Thr31 不能与 Glu35 形成盐桥,使 Glu35 可以与 Arg479 形成盐桥,但 RsWIV1 中的 RBD 残基 Asn479 可能会导致其失去这一能力。因此,BJ01 和 RsSHC014 RBD 可以与中华菊头蝠 ACE2 -1434 结合,但 RsWIV1RBD 无法与中华菊头蝠的 ACE2 -1434 结合。本研究中所有的中华菊头蝠 ACE2 在 82 的位置都包含一个天冬酰胺,而人类 ACE2 在此位置则是蛋氨酸。M82N 的变化引入了一个不利的亲水残基,削弱了热点 31 周围的疏水网络。此外,Asn82 引入了一个糖基化位点,就像在大鼠 ACE2 中一样,导致其不能有效支持 SARS-CoV 感染;ACE2 在 82 位置上的聚糖可能导致空间干扰病毒 RBD 结合。

因此,M82N 可能对 SARS-CoV 及 SARS 相关冠状病毒 RBD 与中华菊头蝠 ACE2s 的相互作用有显著影响。如前所述,RBD 的 487 残基与 ACE2 上的热点 353 相互作用。RsWIV1 RBD 中含有 Asn487, Asn487 的极性侧链可能与 ACE2 中 Lys353 残基的脂肪族部分发生不利的相互作用,影响 K353 与 D38 的热点相互作用。

此外,RsSHC014 RBD 在位置 487 含有一个丙氨酸;Ala 487 的小侧链不支持热点 353 的结构。因此,RsWIV1 及 RsSHC014 RBD 与人类 ACE2 的结合亲和力均低于 BJ01,但与人类 ACE2 的结合亲和力均高于中华菊头蝠 ACE2,这与病毒感染和结合实验结果高度相符。

SARSr-CoV 刺突基因通过正向选择与中华菊头蝠 ACE2 共同进化

为了测试作用于 SARS 病毒刺突蛋白和中华菊头蝠 ACE2 基因可能存在的选择压力,他们使用 PAML 软件包的编码 ml 程序来分析单个密码子的非同义突变与同义突变的比值 ( dN/dS 比值 ) 。通过分析了完整的编码 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列,并比对了来自中华菊头蝠样本的 9 个 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列。

研究发现模型允许密码子在正向选择 ( M2a 和 M8 ) 下进化。在模型 M8 ( 初始种子值 ω ( dN / dS ) = 1.6, 密码子频率 = F3X4 ) , 20 个密码子 ( p > 0.95 ) 以 dN / dS > 1 的速率正向选择,根据晶体结构显示,298 个密码子中有 17 个被发现位于 RBD 区域,面向受体 ACE2。此外,在 SARS-CoV 刺突中出现的 5 个密码子 ( 442、472、479、480 和 487 ) ,此前已被确定对人类 ACE2 的结合亲和力有显著影响。接下来,他们通过比对本研究获得的以及从 GenBank 下载的 25 个中华菊头蝠 ACE2 基因序列,对中华菊头蝠 ACE2 基因进行分析。他们发现在模型 M8 中,12 个密码子 ( 2.3%,p > 0.95 ) 以 dN / dS > 1 的速率进行正向选择,其中 8 个密码子 ( 31、24、27、34、35、38、41、42 ) 对应于人类 ACE2 的残留物,这些密码子直接参与人类 SARS 病毒刺突蛋白的接触。

他们还分析了中菊头蝠 ( R. affinis ) 的 ACE2 基因,有报道称该基因偶尔也能结合 SARS 相关冠状病毒。利用本研究获得的 23 个来自中菊头蝠的 ACE2 基因序列比对,发现中菊头蝠 ACE2 在整个编码区不同个体间的保守性比中华菊头蝠 ACE2 更强,并且没有观察到明显的正向选择位点 ( 数据未显示 ) 。此外,通过查询单核苷酸多态性 ( SNP ) 数据库,他们发现人类 ACE2 基因中的 SNPs 在整个编码区域随机产生。虽然在人类 ACE2 中发现了两个具有非同义突变 ( T27A 和 E35K ) 的 SNP 位点,但它们在全球人群中都显示出罕见的频率 ( 频率分别为 0.00001 和 0.00002 ) 。这些结果表明,在蝙蝠 SARS 相关冠状病毒刺突蛋白与中华菊头蝠 ACE2 的交界面发生了正向选择。

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