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近日，几位来自欧洲的科学家首次在大肠杆菌中成功合成了牛奶中重要的蛋白质成分——酪蛋白。并且，他们使用了两种合成策略，这一成果为未来开发 " 无奶牛的牛奶 " 提供了重要技术基础，给人类实现可持续乳制品的产业化打开了新的想象空间。

撰文  |   MY

不知道大家是否像笔者一样，每天早晨需要一杯醇香浓郁的拿铁咖啡开启高效的一天。拿铁咖啡诱人的香气，除了来自不同产地、不同烘焙方式的咖啡豆之外，牛奶的品质和配比也至关重要。牛奶是重要的营养来源，小时候的 " 每天一杯奶，强壮中国人 " 的广告语至今还深深地印在笔者的脑海中。而奶制品，比如大家爱吃的芝士和酸奶等美食更是现代社会餐桌上的常客。这些美味背后，是全球奶业产量与人口和消费需求的同步增长。养殖奶牛需要大量的土地、水和饲料的同时，还会产生大量的甲烷进一步增加环境的压力。

那么，有没有更环保、更可持续发展的，同时可以大量工业化生产的方式来生产我们所需的 " 牛奶 " 呢？首先我们需要明确，当我们想实现工业化 " 牛奶 " 生产的时候，我们到底要生产什么？是成分色泽口感与牛奶一模一样的 " 牛奶 " 吗？还是生产牛奶中的某些关键营养物质？最重要的是，我们为什么要工业化生产不需要奶牛的 " 牛奶 " 呢？

无奶牛的牛奶，我们要生产什么？

牛奶主要是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素构成的营养全面的乳制品。然而，牛奶中这些重要的成分，只有蛋白质不能通过现代工业快速大量生产。

牛奶中的蛋白质分为两种：酪蛋白（casein），约占总蛋白 80%；剩下的 20% 则是乳清蛋白（whey   protein）。本文主要介绍前者。

酪蛋白这个名字听起来非常像一个无厘头的蛋白棒品牌，但实际上它是营养的直接来源。在人体中酪蛋白会与钙离子形成一个个微小的纳米级蛋白质结构——酪蛋白胶束，它就像一辆 " 钙离子运输车 "，将钙送往全身各处。正因为酪蛋白胶束的存在，牛奶钙的生物利用度相对较高（一般在 30 – 35% 左右，比许多植物来源更容易被吸收）。这也是为什么牛奶被视为膳食钙的优质来源。

从人体摄入营养的角度来说，直接喝牛奶并搭配其他饮食补充蛋白质就已足够了，但对于许多特定功能的应用来说，需要巨量的牛奶来生产提纯，酪蛋白的产量自然是越多越好。从食品工业角度来说，它具有乳化、增稠和保水，以及改善产品质地和口感等优良性质，是蛋白粉、能量棒、营养饮料、婴儿配方奶粉等消费品的主要原料；被广泛应用于酸奶、冰淇淋、奶酪制品、肉类制品和烘焙食品等。

酪蛋白的物理、化学特性对于化工、医药等领域也很有价值。酪蛋白是油漆的基料和高级纸张的涂层，可以提高纸张的光泽度、平滑度和印刷适应性；化妆品中粘合剂和保湿剂不乏它的身影。 [ 插播一个彩蛋：在现代石油基塑料广泛应用前，用酪蛋白制作的一种名为 " 加拉利斯 "（Galalith）的塑料，因其光泽和坚硬度，被用于制作纽扣、钢笔和首饰等。 ]

全球酪蛋白市场在 2023 年价值为 27 亿美元，预计到 2033 年将以 6.3% 的复合年增长率增长到 49 亿美元，这进一步凸显了对可持续生产方式的需求   [ 1 ] 。

因此，我们想要无奶牛的牛奶，本质上是需要酪蛋白。

为什么酪蛋白难以化学合成？

虽然酪蛋白具有重要的产业意义，但很遗憾的是，目前除了对牛奶分离纯化外，还无法通过纯粹的化学方法实现酪蛋白的大规模生产。

图 1 Alphafold 解析出的酪蛋白结构。

原因主要有两点：1）  酪蛋白不是一个单一的蛋白质，而是一组复杂的蛋白质家族，包括 α s1- 酪蛋白（酪蛋白家族最主要的成分）、α s2- 酪蛋白、β - 酪蛋白和 κ - 酪蛋。每一种酪蛋白都由数百个氨基酸以特定的序列组成。纯化学合成如此长且复杂的蛋白质链，成本极高且效率极低，目前根本无法应用于工业生产。

2）即使化学合成出这样复杂的蛋白质链，也很难实现酪蛋白输送营养的功能。酪蛋白分子上布满了大量的磷酸基团，这些磷酸基团必须在特定的氨基酸位点上精确地连接，即磷酸激酶将一个磷酸基团（负电荷）从 ATP 转移到目标蛋白质内氨基酸残基上。这正是形成酪蛋白胶束的关键，这些带负电的磷酸基团就仿佛一个个小的 " 钩子 "，将带正电的钙离子牢牢地抓住，从而将钙运送至全身各处。钩子的数量和位置，决定了它的运输钙离子的能力和结构。而这种复杂的、位点特异性的修饰是由细胞内的生物酶完成的，用化学方法很难精确复制；其形成的胶束结构是生物体内的自组装完成，目前也无法化学方法合成。

图 2   酪蛋白亚胶束和酪蛋白胶束结构示意图：不同的酪蛋白分子聚集形成亚胶束，再由磷酸钙 Ca9 ( Po4 ) 6 将亚胶束维系在一起而构成酪蛋白胶束 [ 2 ] 。

图 3 酪蛋白中的丝氨酸被磷酸化（加钩子）的结构变化。

两种合成策略

多个研究团队都曾尝试用合成生物学的方法，通过毕赤酵母（Pichia pastoris）或者酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）来进行酪蛋白生产 [ 3,4 ] ，然而却因各种原因无法走到工业化的最后一步。但科学家们并没有止步于此，仍在进行各种不同的尝试。

近期，一个欧洲的科学家团队，成功通过生物工程的方式，在实验室水平用大肠杆菌 " 绕过 " 奶牛，实现 α s1- 酪蛋白的精准生产 [ 5 ] 。

食品工业中，大肠杆菌长期以来作为 " 生物工厂 " 用于工业酶、生物分子以及营养补剂的生产。大肠杆菌非常适合生产蛋白质，但是它们天生缺乏磷酸化，即没有加钩子的能力，因此也无法天然合成具有钙运输能力的酪蛋白。为此，研究人员主要采取了 " 激酶共表达 " 和 " 磷酸化模拟 " 两种策略，实现了重组酪蛋白的磷酸化。

图 4 在大肠杆菌中产生具有活性的重组酪蛋白的两种策略 [ 5 ] 。

" 激酶共表达 "，如字面意思所示，在用大肠杆菌表达酪蛋白的同时，还让其同时表达磷酸激酶。这些外来的磷酸激酶可以精准地对酪蛋白磷酸化，从而使最终生产的酪蛋白是具有钙离子结合活性的天然酪蛋白。

研究人员首先从一系列的激酶中选取了人类和牛的 Fam20C 激酶（一种在细胞外蛋白质磷酸化起关键作用的激酶），验证这两种激酶是否可以磷酸化牛的 α s1- 酪蛋白。然而实验发现，大肠杆菌并不能合成来自哺乳动物的复杂的 Fam20C 激酶蛋白。因此他们转向使用枯草芽孢杆菌的两种 Hanks 型激酶—— PrkD 和 YabT；这两种激酶已经充分表征（characterization），且在大肠杆菌中成功表达，因此有望对酪蛋白磷酸化。

事实上，上述这两种激酶均可使蛋白质中的丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基发生磷酸化。研究人员将 α s1- 酪蛋白基因和 " 加钩子 " 的工具激酶基因（PrkD 或 YabT）同时放在工具箱（pET15b 质粒）中，进而将 pET15b 质粒送入大肠杆菌中表达。除此之外，研究人员还在其中加入了伴侣蛋白 GroES/EL 以保证 α s1- 酪蛋白可以正确折叠和溶解。

在 α s1- 酪蛋白成功表达之后，研究人员接下来便来探究这些大肠杆菌表达的酪蛋白是否带有 " 钩子 "。通过在试管中进行放射性磷（32P）标记实验，研究人员成功证明了酪蛋白确实被这两种激酶磷酸化了。为了进一步确定磷酸化发生的具体位点，他们通过液相色谱 - 质谱联用（LC-MS）的方法发现 PrkD   激酶磷酸化了酪蛋白中所有的 9 个天然位点，而 YabT 磷酸化了其中的 8 个。这表明两种激酶 PrkD   和 YabT 具有生物活性的同时，还能够高度精确地复制天然酪蛋白的磷酸化模式。研究人员还通过二维凝胶电泳（2DE）的方法将磷酸化的 α s1- 酪蛋白进行染色，清晰地看到 PrkD 或 YabT 共表达的 α s1- 酪蛋白产生了强烈的磷酸化信号，并且磷酸化水平与商业化的天然 α s1- 酪蛋白相当。最后，研究人员又通过钙结合分析和荧光光谱等方法，评估了大肠杆菌生产的磷酸化酪蛋白的功能和结构特性，发现其与牛酪蛋白具有可比性。

尽管大肠杆菌能够同时表达这三个蛋白（激酶蛋白、酪蛋白、伴侣蛋白），但这种多蛋白共表达系统会对大肠杆菌菌株造成显著的代谢负担。这种负担可能导致大肠杆菌无法处于其最佳生长状态，进而影响蛋白质的表达产量和生产效率。因此接下来研究人员提出了一种曲线救国的方法—— " 磷酸化模拟修饰 " 来生产磷酸化的 α s1- 酪蛋白。

前文提到过，酪蛋白之所以可以和钙离子结合，是因为带负电的磷酸基团和带正电的钙离子之间的相互吸引作用。由于某些氨基酸本身就带有负电荷，那么是否可以用带负电的氨基酸替换掉酪蛋白中原来的丝氨酸磷酸化位点，进而模拟磷酸基团抓钙离子的功能呢？

于是，研究团队选择了带负电荷的天冬氨酸，用它替代了酪蛋白中 8 个潜在的丝氨酸磷酸化位点，即用 " 假钩子 " 替换 " 真钩子 "。这种基因层面上的方法，无需添加激酶，省去了复杂的 " 加钩子 " 步骤，能在蛋白质翻译后直接获得 " 磷酸化 " 的效果，从生产角度来说更简单高效。

研究人员将天冬氨基酸替换的 R α s1-PM 酪蛋白的基因序列在大肠杆菌中表达之后，发现 R α s1-PM 酪蛋白突变体增强了和钙离子间的静电相互作用。在使用荧光光谱分析时，磷酸化模拟酪蛋白的荧光发射波长发生了 " 蓝移 "  ，这意味着蛋白质的构象或寡聚化状态发生了改变。也就是说，磷酸化模拟酪蛋白与天然酪蛋白有结构差异，而这种差异使其表现出更强的钙结合能力。此外，动态光散射（DLS）测量显示，R α s1-PM 酪蛋白突变体的流体动力学直径比未磷酸化的酪蛋白更大，这进一步证明了其寡聚化状态发生了变化。这些结构变化是使 R α s1-PM 酪蛋白具有更强钙离子结合能力的重要原因。

与第一种方法相比，这种磷酸模拟化策略使生产过程变得更为简单的同时，还会得到具有更强钙离子结合能力的 " 酪蛋白 "。这种强结合能力的 " 酪蛋白 " 与普通的酪蛋白相比，可能具有更高的营养性价比。

从 0 到 1 的进步

综上所述，这项研究的成功之处在于解决了利用微生物生产具有生物活性酪蛋白的长期难题——在天然位点实现磷酸化。研究人员提出的两种可行性生产方案为未来的工业化生产提供了两种不同路径。当然，这只是最开始的第一步，这其中还有许多悬而未解决的问题需要进一步的探究。论文作者只合成出 α s1- 酪蛋白，文中的两种策略是否可以应用到其他类型的酪蛋白（如 β - 酪蛋白和 κ - 酪蛋白）？更重要的是，该研究并未得到胶束结构，只实现了基本的 " 钩子 " 能力。文中也明确指出，重组酪蛋白是否能形成与天然酪蛋白一致的胶束结构是未解决的关键问题。细菌激酶磷酸化的重组酪蛋白是否能像天然酪蛋白一样形成稳定的磷酸钙纳米胶束？磷酸化模拟修饰能在多大程度上复制磷酸基团的胶束稳定化和其拥有的生物物理功能？而更遥远的未来，若能够实现量产，在提高蛋白产率的同时，能否在成本上与普通动物性酪蛋白生产持平或更具优势？

不过，对于生物工程来讲，从 0 到 1 往往很难。现在已经有了酪蛋白的 1，接下来通过研究人员对实验过程、蛋白质结构、生产过程的优化，实现重组酪蛋白的规模化和可持续化生产，值得期待。

参考文献

[ 1 ]   Future Market InsightsCasein Market - Increasing Adoption of Dairy Proteins in Emerging Economies Is Shaping Casein Market. 2023-2033

[ 2 ] Petrova, S. Y., et al. "Structure and biological functions of milk caseins." Russian Open Medical Journal, vol. 11, 2022, p. e0209, www.romj.org/2022-0209.

[ 3 ]   Choi, B. K., & Jim é nez-Flores, R. ( 2001 ) . Expression and purification of glycosylated bovine  β -casein ( L70S/P71S ) in Pichia pastoris. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 ( 4 ) , 1761 – 1766  。

[ 4 ]   Hettinga, K., & Bijl, E. ( 2022 ) . Can recombinant milk proteins replace those produced by animals? Current Opinion in Biotechnology, 75, 102690.  

[ 5 ] Suvasini Balasubramanian et al, Production of phosphorylated and functional α s1-casein in Escherichia coli, Trends in Biotechnology ( 2025 ) . DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.05.015

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