双载荷 ADC 的三种主流制备方法

双载荷 ADC 的制备核心是实现两种载荷的偶联与协同作用，目前行业内主流的方法分为以下三类：

1. 单点多功能分支连接子偶联：在抗体单一特定位点修饰分支连接子，同步偶联两种载荷。

2. 双位点正交化学反应偶联（无任何酶介入）：采用两套正交、互不交叉反应的化学偶联策略，在抗体两个不同特定位点，分别偶联一种载荷。

3. 双位点正交偶联（至少一步酶介导）：利用酶的特异性在抗体正交位点进行修饰，可连接带有正交点击化学手柄的连接子，进而通过 " 一锅法 " 或分步偶联方式连接两种载荷。

图 1   三种制备均质双载荷 ADC 的方法

案例分析：双位点双载荷 ADC 偶联工艺开发

相较于单点偶联法，双位点双载荷偶联能有效解决毒素连接子合成复杂、双载荷协同性不足等痛点，但该技术的工艺复杂性远超单点偶联。多步偶联工艺（如位点改造、两步正交偶联、多次纯化）的相互影响易导致产品异质性增强，出现多种 DAR 值分布（见图 2），严重影响产品疗效与临床申报合规性。这也是当前制约双位点双载荷 ADC 发展的核心技术瓶颈。

图 2   双位点双载荷 ADC 产品（目标 DAR 值 4+4）可能的 DAR 分布情况

本案例将以糖定点偶联 + 链间半胱氨酸偶联为例，拆解双位点双载荷 ADC 的偶联工艺开发策略。

图 3   双位点双载荷 ( 糖定点偶联 + 链间半胱氨酸偶联 ) ADC 制备流程示意图

糖定点偶联 + 链间半胱氨酸偶联是目前双位点双载荷 ADC 最常用的偶联方式之一，具有无需抗体改造、正交性优异、工艺成熟、适配性广泛、可兼容多数载荷组合等优点。其制备流程（图 3）和控制策略（图 4）已经过多个项目验证。结合凯莱英生物的项目实战经验，具体可分为以下七大核心步骤：

1.   糖修饰天然抗体：以天然 IgG 抗体为底物，采用糖基转移酶催化反应，在抗体 Fc 区糖链位点特异性引入 click 反应基团；

2.   第一步纯化：去除反应体系中未反应的糖基供体、游离糖基转移酶，同时测试中间品稳定性；

3.   载荷 1 偶联反应：采用点击化学偶联技术，将载荷 1 与抗体糖链位点进行特异性偶联；

4.   第二步纯化：去除未反应的药物连接子 1，同时测试中间品稳定性；

5.   还原反应：加入温和还原剂，通过控制还原反应条件，选择性还原抗体链间二硫键；

6.   载荷 2 偶联反应：采用半胱氨酸偶联反应，将载荷 2 与抗体链间半胱氨酸的巯基进行特异性偶联；

7.   第三步纯化：去除未反应的药物连接子 2 及其它相关杂质，最终获得高纯度双位点双载荷 ADC 产品。

图 4   双位点双载荷 ADC 的工艺控制策略

为确保工艺的稳健性和双位点双载荷 ADC 的产品质量，AsymBio 采用 " 分步工艺开发 + 中间品全程质控 + 逐级工艺放大 " 的策略，完成了全流程工艺开发。在不同反应规模下，产品 DAR 值始终稳定保持稳定，批间 DAR 值差异控制在 5% 以内，充分验证了该工艺的稳健性与可放大性。

结语

凯莱英生物依托丰富的偶联 Tool-box 平台，可灵活支持糖定点偶联、链间半胱氨酸偶联等多种组合偶联工艺的开发，结合成熟的中控策略和分析平台，实现过程控制（IPC）与产品放行检测的全流程覆盖。采用 RP-HPLC、LC-MS 等专业检测手段，确保每一批产品的质量稳定、合格。

未来，随着双载荷设计理念在更多靶点与适应症中的拓展，ADC 的药物形式将不断演进。凯莱英生物将继续深耕偶联工艺技术平台的开发能力，助力偶联创新药的发展。

参考文献

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